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ZeyNGS Tn5转座酶是一种来源于E.coli、经过改造具有极高活性的Tn5转座酶突变体，可以高效地将Tn5转座子(Transposon)随机插入到目标序列，对于真核和原核生物的DNA都有极高的转座插入效率。本制品可以特异性识别两端含有嵌合末端序列的DNA片段(包括含有ME序列的引物)，最终形成Tn5转座体(Tn5 Transposome)，该转座体可以随机结合靶DNA并切割插入其携带的DNA片段。Tn5转座酶被广泛用于体外转基因(外源基因整合到宿主细胞)和二代测序(NGS)建库等领域。

ZeyNGS Tn5转座酶是表达、纯化获得的重组蛋白，与野生型Tn5转座酶相比，其插入效率至少提升1000倍，具有转座随机性好、稳定性高、插入位点易测序等特点。

本制品可用于二代测序(NGS)文库构建时的片段化和加接头；将测序引物引入克隆DNA或质粒；细菌基因敲除库的建立；新型细菌菌株工程改造；目的基因的插入失活；将T7转录启动子、抗性标记等插入靶DNA等。


转座子(Transposon)，也称为转座元件(Transposable elements,TEs)、跳跃基因(Jumping genes)，是一种可以在基因组中“跳跃”到不同位置的遗传元件(Genetic elements)。尽管转座子经常被称为跳跃基因，转座子还是会相对比较稳定地存在于相应的整合位点，并且大部分转座子最终会变得没有跳跃活性。转座子最早由Barbara McClintock在玉米中发现，并在1983年获得了诺贝尔生理医学奖。后续研究发现转座子系统广泛存在于生物界，并逐渐研究开发成为基因分析的有效工具。



图1．百奥莱博的ZeyNGS Tn5 Transposase的工作原理图。
ZeyNGS Tn5 Transposase与Tn5 Transposase的工作原理相同。Tn5转座酶的工作原理如图1所示。当转座事件发生时，两个Tn5转座酶分子结合到供体DNA (Donor DNA)的转座子的ME序列，形成两个Tn5转座酶分子与供体DNA的复合物①，随后两个Tn5转座酶分子通过C末端相互作用进行联会并环化(Circularization)转座子，形成一个Tn5转座酶二聚体复合物(Transposase dimer complex)②，在Mg²⁺存在的条件下，Tn5转座酶切割供体DNA，并携带供体DNA片段离开供体链形成转座体(Transposome)③，当Tn5转座体识别靶点DNA (Target DNA)，也称受体DNA (acceptor DNA)，并结合到随机靶序列(Target site)上形成转座体与靶序列的复合物④，在Mg²⁺存在条件下，会对靶序列进行切割，将其携带的供体DNA片段插入靶序列中，形成转座后的DNA序列(Transposed DNA)⑤，切割形成的9bp粘性末端可以通过DNA聚合酶、连接酶作用进行填补，最终两端形成9bp正向重复序列。基因从供体DNA通过Tn5转座酶“剪切”之后“粘贴”到另一受体DNA，实现了基因片段在基因组中的“跳跃”。


50mM HEPES (pH7.2)，100mM NaCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.1% Triton X-100，50% (v/v) Glycerol。


5×Reaction Buffer：
50mM HEPES (pH7.2)，500mM NaCl，50mM MgCl₂。
5×Stop Buffer：
50mM EDTA (pH8.0)。

组分	800pmol	4000pmol
ZeyNGS Tn5转座酶(40μM)	20μL	100μL
5×Reaction Buffer	200μL	1mL
5×Stop Buffer	300μL	1.5mL

保存：-20℃，有效期1年。


用于体外转座子插入反应时，按每次使用1μL ZeyNGS Tn5转座酶(40μM)，本制品小包装可以进行20次反应，中包装可以进行100次反应。

• ZeyNGS Tn5转座酶(40μM)含50%甘油，在-20℃保存不会冻结。须避免-80℃保存，否则会冻结，反复冻融可能会影响Tn5转座酶的活性。
  
• ZeyNGS Tn5转座酶较为粘稠，吸取时注意取样量准确，加样后请注意充分吹打混匀，避免产生气泡。
  
• ZeyNGS Tn5转座酶催化的底物为DNA，不能用于RNA实验。
  
• 本制品用于转座子插入时只适用于细菌，真核细胞由于核膜的阻挡导致转座子难以插入。具体的反应条件请根据相关文献自行设计和调整。
  
• 用于细菌相关研究时，请勿使用化学感受态细胞，化学转化的成功概率极低。推荐使用电转化效率不低于10⁶cfu/μg的电转感受态细胞。

• 体外转座子插入反应和转化
  
  • Tn5转座子的设计。Tn5转座子是两侧带有19bp ME序列的DNA片段，可以使用含有ME序列的上下游引物进行PCR合成。为了获得最佳的转座效率，在两端的PCR引物中需要添加一个5'磷酸基团。典型的Tn5转座子参考图2。
    ME序列:5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'
    
    图2．Tn5转座子示意图。Tn5转座子其两端为19bp ME序列，ME序列可被ZeyNGS Tn5转座酶特异性识别。
    
  • 按照下表制备转座子插入混合物。配制过程中需要注意目标DNA纯度，确保无外源核酸污染。
    

    成分	用量
    5×Reaction Buffer	2μL
    Target DNA	0.2μg
    molar equivalent Tn5 Transposon	x μL
    ZeyNGS Tn5转座酶(40μM)	1μL
    ddH2O	至10μL

    • 为了避免多余片段的插入，需要计算反应中使用的目标DNA摩尔数，并加入等摩尔量的Tn5转座子片段以减少产生过多插入的可能性。μmol target DNA=μg target DNA/[(base pairs in target DNA)×660]，例如：0.2μg 5000bp的目标DNA = 0.2μg/[5000bp×660]=0.06×10^-6μmol = 0.06pmol。
  • 混匀后37℃孵育2小时。
    
  • 加入2μL 5×Stop Buffer，混匀后55℃孵育10分钟终止反应。
    
  • 取1μL混合物电击转化到感受态细胞中，根据抗性标记筛选阳性菌株。未使用的混合物可以-20℃保存。推荐的电击转化条件：50μL感受态细胞，1μL混合物，2毫米电击杯，2500V，电击时间5毫秒。转化条件可根据该条件的转化效果进行优化。转座的克隆数主要取决于所转化的宿主细胞、内源性的限制修饰系统及感受态细胞的转化效率。
• ZeyNGS Tn5转座体复合物的构建和转化后的体内插入
  
  • 按照下表依次加入相应试剂，制备Tn5转座体复合物混合物。
    

    成分	用量
    Tn5 Transposon DNA(100μg/mL in TE Buffer)	2μL
    ZeyNGS Tn5转座酶(40μM)	4μL
    Glycerol(100%)	2μL
    总反应体积	8μL

    • 本反应无须Mg²⁺催化，请勿使用5×Reaction Buffer。
      
    • 参考1a中Tn5的转座子设计，Tn5 Transposon DNA为含选择标记(如抗性标记)、成对识别序列(如ME序列)和目标基因的双链DNA，可通过PCR等方法获得。
      
    • 本反应体系可根据实际需要进行放大或缩小。
  • 混匀后室温孵育0.5～1小时。
    
  • 取1μL的转座体复合物电击转化到感受态细胞中，在体内进行插入，并根据抗性标记筛选阳性菌株。推荐的电击转化条件：50μL感受态细胞，1μL转座体复合物，2毫米电击杯，2500V，电击时间5毫秒。转化条件可根据该条件的转化效果进行优化。转座的克隆数主要取决于所转化的宿主细胞、内源性的限制修饰系统及感受态细胞的转化效率。
    
  • 构建好的转座体复合物-20℃可以保存1年。
• 构建二代测序所需的ZeyNGS Tn5转座体
  
  • ME和接头(Adapters)的序列
    ME:5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'
    Primer 1:5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'
    Primer 2:5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'
    本接头序列参考Nextera DNA Sample Preparation Kit (Illumina,FC-121-1030)，也可按照不同高通量测序的要求进行设计。
    
  • 制备Adapter 1和Adapter 2
    按照下表分别配制Adapter 1和Adapter 2退火反应体系。退火反应后Adapter 1或Adapter 2的终浓度为200μM。
    

    成分	用量
    5×DNA寡核苷酸退火缓冲液(货号：YT483)	10μL
    ME (500μM)	20μL
    Primer-1 or 2 (500μM)	20μL
    Total Reaction Volume	50μL

    
    在PCR仪设置退火反应程序：
    

    Step	Temperature
    1	95℃,2min
    2	95℃,8s,-0.1℃ per cycle
    3	GOTO step 2,700 cycles
    4	4℃ forever

    
    
  • ZeyNGS Tn5转座体的制备
    按照下表，将ZeyNGS Tn5转座酶、Adapter 1和Adapter 2按摩尔比1:0.5:0.5混合，吹打混匀，室温孵育1小时。
    • 可根据实验需要适当提高Tn5转座酶的混合比例，但Adapter 1和Adapter 2的浓度需要保持一致。制备好Tn5转座体可直接用于DNA片段化实验，也可以-20℃保存。

    成分	用量
    ZeyNGS Tn5 Transposase	10μL
    Adapter 1 (200μM)	1μL
    Adapter 2 (200μM)	1μL

    
    
  • 片段化(Tagmentation)效果测试
    按照下表配制反应体系，轻轻吹打混匀后，55℃孵育5～10分钟。随后加入5μL 5×Stop Buffer，混匀后55℃孵育5分钟终止反应，片段化的产物可用于检测或纯化后建库，效果参考图3。根据打断片段的大小调整复合体用量，如果片段过长，增加转座体的使用量；如果片段过短，则减少转座体的使用量。
    

    成分	用量
    DNA	50～100ng
    Tn5转座体	0.5～2μL
    5×Reaction Buffer	4μL
    ddH2O	至20μL

图3．ZeyNGS Tn5转座酶制备的Tn5转座体用于DNA随机片段化的效果测试图。在20μL反应体系中，加入100ng Lambda DNA及相应量的Tn5转座体，55℃孵育10分钟，反应完毕入5μL 5×Stop Buffer，混匀后55℃孵育5分钟终止反应，加入5μL 6×DNA上样缓冲液(货号：YT418)，使用BoGel琼脂糖预制胶进行电泳检测。实际效果会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
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